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技術(shù)文章
近年來，大家對基因治療藥物的關(guān)注激增。為了保證治療有效，必須將轉(zhuǎn)基因（基因載荷）正確地運(yùn)送到目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)。其中腺相關(guān)病毒（AAV）作為載體具有眾多優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛用作基因運(yùn)送工具。
隨著AAV在臨床上的應(yīng)用越來越廣泛，了解它的質(zhì)量屬性對產(chǎn)品療效和安全性的影響變得很有必要。目前用于表征AAV的分析技術(shù)也有很多，其中包含離子交換色譜（IEX）、體積排阻色譜（SEC）、反相液相色譜（RPLC）和親水作用色譜（HILIC）等的色譜方法被越來越多地應(yīng)用起來。以下是四種表征AAV的色譜分析策略分享。
陰離子交換色譜法（AEX）
測定AAV中空衣殼和完整衣殼含量
Protein-Pak Hi Res Q, 5 μm, 4.6×100 mm（部件號：186004931）
圖1. 在Protein-Pak Hi Res Q?譜柱上分離AAV8空?殼和完整?殼混合物。20 mM Tris pH 9，NaCl在20 min內(nèi)從 0增加?300 mM，流速0.4 mL/min。a?c)進(jìn)樣6 μL。a) 260 nm處的TUV。b) 280 nm處的TUV。c)熒光檢測：激 發(fā)波?280 nm，發(fā)射波?350 nm。d)進(jìn)樣0.5 μL的熒光檢測結(jié)果。20 mM Tris pH 9，NaCl在20 min內(nèi)從50增加 ?250 mM，流速0.4 mL/min。
圖2. 使?優(yōu)化的AEX?法定量各種AAV8空?殼和完整?殼混合物中的空?殼百分?。
A.
UV檢測結(jié)果：由于260 nm處病毒DNA的吸光度高于衣殼蛋白，280 nm處衣殼蛋白吸光度高于DNA，所以完整衣殼在260 nm處的峰面積大于280 nm處，而空衣殼在260 nm處的峰面積小于260 nm處；
B.
同樣的分離方法下，熒光信號遠(yuǎn)高于UV檢測信號；
C.
使用從緩沖液pH值、鹽類型、緩沖液類型和鎂離子濃度等方面優(yōu)化的AEX分離方法后監(jiān)測AAV8樣品中的空衣殼/完整衣殼，得到較好的線性結(jié)果。
XBridge Premier GTx BEH SEC色譜柱，450?，2.5 µm，4.6 x 150 mm（
部件號：186010584）
圖3. 分別使用流速0.6 mL/min（2.5 μm顆粒，5分鐘分析時間，黑色曲線）的XBridge Premier GTx BEH SEC 450 ? 2.5 µm柱；和流速0.05 mL/min（5 μm顆粒，50分鐘分析時間，紅色曲線）的參考500 ?柱所獲得的AAV2（A）、AAV9（B）、AAV5-空（C）和AAV5-滿（D）SEC色譜圖的放大視圖。
A.
相比5 μm的色譜柱，XBridge Premier GTx BEH 450 ? 2.5 μm具有更高的柱效，使得AAV的分離進(jìn)一步提升；
B.
擁有MaxPeak HPS技術(shù)的XBridge Premier GTx BEH 450 ?色譜柱由于避免了次級作用力，分離結(jié)果重現(xiàn)性更高。
反相液相色譜法
分離AAV載體中的衣殼蛋白（VP）
ACQUITY UPLC BEH C4, 1.7 μm, 300 ?, 2.1 ×100 mm蛋?分析專?柱（部件號：186004496）
圖4. AAV8?殼蛋?分析?法開發(fā)。(A) 使?ACQUITY UPLC BEH C8?譜柱并以甲酸作為流動相改性劑得到的分離結(jié)果；(B) 使?相同的ACQUITY UPLC BEH C8?譜柱，以DFA作為流動相改性劑得到的分離結(jié)果；(C) 使?ACQUITY UPLC BEH C4?譜柱并以DFA作為流動相改性劑，分離度有所提升。梯度：(A) 流動相A在32 min內(nèi)從70%降? 62%；(B) 流動相A在16 min內(nèi)從67%降?63%；(C) 流動相A在16 min內(nèi)從68%降?64%。流速：0.2 mL/min。
A.
相較于甲酸等傳統(tǒng)的流動相添加劑，二fu乙酸更有利于各衣殼蛋白的色譜分離，同時保持出色的MS靈敏度；
B.
對比130 ?的C18，孔徑為300 ?的C4使得VP1、VP2得到進(jìn)一步分離，峰寬更窄，MS響應(yīng)進(jìn)一步提高。
親水作用色譜
分離AAV載體中的衣殼蛋白（VP）
ACQUITY UPLC Amide糖蛋白分析專用柱， 300 ?, 1.7 μm, 2.1 mm × 150 mm（部件號：186007963)
圖5. 使用以下兩款 LC 色譜柱分離AAV6、AAV7和AAV8 衣殼病毒蛋白(VP)所得的譜圖對比：(a) Waters ACQUITY UPLC Amide糖蛋白分析專用柱(300 ?, 1.7 μm, 2.1 mm × 150 mm)和(b)Waters ACQUITY BEH C4色譜柱(300 ?, 1.7 μm, 2.1 mm × 150 mm)。在λem = 280 nm 和λex = 348 nm 波長下監(jiān)測熒光強(qiáng)度(EU)，且所有樣品的熒光強(qiáng)度都經(jīng)過歸一化處理。FD的譜峰歸屬根據(jù)準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)測定結(jié)果做了確認(rèn)，標(biāo)示如下：Ox：氧化；P：磷酸化。
ACQUITY BEH Amide色譜柱、ACQUITY BEH C4色譜柱在相同的離子對試劑（0.1%TFA v/v），且單位時間流動相B的變化也相同（%B/min）條件下分離三種不同AAV血清型的衣殼蛋白。結(jié)果表明ACQUITY BEH Amide色譜柱可以更好地分離VP變體。
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